کشت بافت گیاهی و کاربردها و مزایای آن

مقدمه

کشت بافت گیاهی اولین بار در سال ۱۹۰۲ توسط هابرلنت از آکادمی علوم آلمان پیشنهاد گردید و با عنوان‌های کشت درون شیشه (Invitro)، کشت آزمایشگاهی و کشت استریل نامیده شد. نتایج آزمایش‌های هابرلنت بیانگر خواص و پتانسیل‌های سلول به‌عنوان یک ارگانیسم اساسی بود.

هابرلنت تحقیقات گسترده‌ای روی کشت بافت گیاهی انجام داد و به‌عنوان پدر کشت بافت گیاهی نام گرفت. تکنیک کشت بافت گیاهی بر اساس مفهوم Totipotency سلول‌ها (قابلیت و ظرفیت تبدیل‌شدن هر سلول به یک موجود کامل) شکل‌گرفته است.

اصول کشت بافت گیاهی بسیار ساده است و اساساً تلاشی است که بدان وسیله یک ریزنمونه (explant) می‌تواند فارغ از اثرات متقابل بین اندامی، بین بافتی و بین سلولی در آزمایشگاه و تحت شرایط کنترل‌شده‌ی محیطی تکثیر شود.

معمول‌ترین کشت در کشت بافت گیاهی، کشت کالوس (callus) است که بافتی متشکل از سلول‌های تمایز نیافته و غیر سازمان‌یافته می‌باشد. همچنین مریستم، نوک ساقه، جوانه‌های جانبی، برگ، دم برگ، بساک، تخمدان، تخمک، جنین و… می‌توانند به‌عنوان ریز نمونه برای کشت بافت گیاهی استفاده شوند.

تاریخچه کشت بافت گیاهی

پس از هابرلنت، دانشجویان وی، کار او را روی گیاه گوجه ‌فرنگی ادامه دادند. کشت نوک ریشه، جوانه و جنین گونه‌های درختان میوه به‌عنوان اولین کاربردهای کشت Invitro محسوب می‌گردند. دهه‌های ۱۹۴۰ تا ۱۹۶۰ دوره‌ی تحول و بهبود روش‌های قبلی و ابداع تکنیک‌های جدید در کشت بافت گیاهی محسوب می‌شود.

استفاده از تنظیم‌کننده‌های رشد متعدد و افزودن مواد آلی مختلف به انواع محیط‌های کشت، تشخیص تأثیر هورمون‌های اکسین به سیتوکینین در رشد، شناسایی فرمول غذایی گیاهان برای تهیه محیط کشت‌های مغذی اولیه برای رشد بافت گیاهی، کشت پروتوپلاست و دانه‌های گرده ازجمله مواردی هستند که در طی این دهه‌ها انجام‌شده است.

با وجود شروع تکنیک‌های فوق در اواسط دهه ۶۰ تا دهه‌های ۷۰ و ۸۰ افزایش چشمگیری در کاربرد آن‌ها در مسائل مختلف نظیر بیولوژی پایه، کشاورزی، باغبانی و جنگلداری صورت گرفت.

کشت بافت گیاهی روشی آسان برای تولید و تکثیر گیاهان مختلف

تولید گیاهان عاری از عوامل بیماری‌زا و ذخیره ژرم پلاسم

از ژرم پلاسم گیاهان عاری از عوامل بیماری‌زا برای انتقال مواد زنده‌ی گیاهی به سراسر جهان استفاده می‌شود. توانایی تولید گیاهان عاری از ویروس، با کشت مریستم به‌طور گسترده‌ای از دهه‌ی ۶۰ تاکنون استفاده‌شده است. این روش مخصوصاً برای عاری سازی از ویروس مدنظر می‌باشد.

از کشت مریستم اغلب همراه با گرما درمانی برای نابودی ویروس‌ها استفاده می‌شود. به‌طورمعمول ژرم پلاسم به‌صورت بذر نگهداری می‌شود؛ اما امکان باز زایی گیاهان کامل از سلول‌های سوماتیکی، گامتی و نوک ساقه، منجر به استفاده از آن‌ها در ذخیره مواد گیاهی شده است. مواد گیاهی به سه روش ذخیره می‌شوند:

1. استفاده از ترکیبات به تأخیر اندازنده رشد مانند آبسیزیک اسید و مالیک هیدرازید.
2. درجه حرارت‌های پایین غیر یخ زننده (۹-۱ درجه سانتی‌گراد).
3. استفاده از دستگاه فریز درایر (حفاظت انجمادی) که در این روش، مواد ذخیره‌ای را پس از تیمار با یک ماده‌ی محافظ انجماد، منجمد کرده و در نیتروژن مایع با دمای ۱۹۶ درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌کنند (این روش بیشتر برای گونه‌های در حال انقراض و کمیاب استفاده می‌شود).

تولید و تکثیر درختچه‌های زینتی و درختان چوبی کند رشد

از تکنیک کشت بافت گیاهی به‌طور گسترده‌ای جهت تکثیر درختچه‌های زینتی و درختان استفاده می‌شود، اما به دلیل مشکل بودن کشت گیاهان چندساله در مقایسه با گیاهان علفی، کاربرد این تکنیک در این زمینه کمتر از سایر گیاهان می‌باشد.

در اکثر گیاهان چوبی، ابتدا از ریز نمونه‌ی اندام هوایی مانند انتهای شاخه و جوانه‌های جانبی استفاده می‌شود؛ زیرا منبع مناسبی برای تهیه‌ی بافت بوده، مشکلات رشد فصلی، دوران خواب و طولانی بودن زمان کشت را حل کرده و به‌راحتی در محیط کشت استقرار پیدا می‌کنند.

از لحاظ بیولوژیکی گیاهان چوبی موفق در تکنیک کشت بافت، گیاهانی هستند که دارای رشد سریع‌تری بوده و ازلحاظ اقتصادی ارزش نسبتاً بالایی برای فروش داشته باشند و سوددهی تجاری بالایی داشته باشند مانند گیلاس وحشی و سرخدار.

تولید گیاهان هاپلوئید از طریق کشت بساک یا گرده

گیاهان هاپلوئید به چند دلیل اهمیت دارند، این گیاهان تنها یک دسته کروموزوم دارند و حتی جهش‌های مغلوب در آن‌ها تظاهر فنوتیپی داشته و به همین دلیل متخصصان اصلاح نباتات علاقه‌ی ویژه‌ای به تولید گیاهان هاپلوئید نشان می‌دهند؛ زیرا با دو برابر کردن کروموزوم‌ها با استفاده از موادی نظیر کلشی سین، به گیاهان کاملاً هموزیگوت دست می‌یابند. با استفاده از کشت بافت می‌توان بساک یا گرده‌ی این گیاهان را کشت کرد و گیاهان کاملاً یکسانی ازلحاظ فنوتیپی و ژنوتیپی تولید کرد.

تولید هیبریدهای نادر از طریق کشت جنین (به نژادی گیاهان)

مطالعه‌ی جنین‌های زیگوتی نارس، محققان را در پیشبرد چگونگی تکامل جنین و بلوغ بذری یاری می‌کند. هینگ در سال ۱۹۴۰ برای اولین بار تولید گیاه کامل از کشت جنین‌های ایزوله را گزارش کرد. کشت جنین‌های نارس ارکیده در دستیابی به هیبریدهای نادر نقش مهمی داشته است.

تکنیک نجات جنین ابزار با ارزشی برای اصلاح‌کنندگان گیاهان در به دست آوردن هیبرید در گیاهانی است که به‌صورت معمول دارای تلاقی‌های عقیم می‌باشند. در این نوع گیاهان، جنین حاصل از تلاقی را جدا نموده و در محیط Invitro کشت می‌کنند تا به یک گیاه کامل تبدیل شود.

تولید هیبریدهای غیرمعمول با ترکیب پروتوپلاست دو گونه‌ی مختلف

پروتوپلاست هنگامی به دست می‌آید که دیواره‌ی سلول گیاهی حذف گردد. هیبریدهای غیرمعمول را که نمی‌توان با تلاقی جنسی انجام داد، با ترکیب پروتوپلاست دو گونه‌ی متفاوت می‌توان تولید کرد؛ مانند هیبرید بین سیب‌زمینی و گوجه‌فرنگی که در دهه‌ی ۸۰ توسط دانشمندان صورت پذیرفت.

پروتوپلاست می‌تواند در بروز موقت ژن مورد آزمایش روی گیاه قابل‌استفاده باشد. همچنین مطالعه‌ی مسائل فیزیولوژیکی سلول با استفاده از پروتوپلاست امکان‌پذیر است. برای تهیه‌ی پروتوپلاست می‌توان سلول‌ها را از منابع مختلفی مانند کالوس و یا کشت سوسپانسیون بافت گیاهی تهیه نمود.

تولید گیاهان مختلف از طریق باز زایی و اندام‌زایی

در گیاهان عالی تولید مثل معمولاً از نوع جنسی است که بدان وسیله گیاه جدید از بذر تولید می‌شود. با این‌حال در بسیاری از گیاهان گل‌دار ممکن است تولیدمثل رویشی نیز داشته باشیم؛ یعنی تولید گیاهان جدید از قطعه‌ای از اندام‌ها، بافت‌ها یا سلول‌های گیاهی در شرایط Invitro.

سلول‌های گیاهی ممکن است از طریق یک یا دو مسیر مختلف ایجاد یک گیاه کامل نمایند:

1. جنین زایی رویشی (Somatic embryogenesis) که مانند مراحل جنین زایی زیگوتی است.
2. اندام‌زایی (Organogenesis) که تحت شرایط مناسب با نسبت‌هایی از اکسین و سیتوکینین بعد از تنظیم شرایط هورمونی به‌طور متوالی ساقه و ریشه ایجاد می‌گردد.

به‌طور طبیعی اندام‌زایی خاصیت بافت‌های رویشی است، درحالی‌که جنین زایی خاصیت بافت‌های زایشی است. جنین زایی سوماتیکی فرآیندی است که طی آن، سلول‌های رویشی تمایز یافته و تشکیل ساختار دوقطبی شامل محور ریشه و ساقه می‌دهند. در این حالت، کالوس‌ها را بر روی محیط حاوی اکسین قرار داده و سلول‌های مریستمی را تحریک به تشکیل جنین می‌کنند.

تولید گیاهان زینتی جهت تولید تجاری

یکی از کاربردهای عمده‌ی تکنیک کشت بافت گیاهی، سرعت بخشیدن به تکثیر رویشی گیاهان زینتی است. با استفاده از تکنیک‌های کشت سلول، تولید سریع گیاهان مشابه وجود دارد. در این حالت طی چند مرحله تعداد بسیار زیادی گیاه تولید می‌گردد:

مرحله‌ی اول

تهیه‌ی تعداد مناسبی ریز نمونه‌ی استریل

مرحله‌ی دوم

مرحله‌ی پر آوری (Proliferation) که در این مرحله اندام هوایی گیاه چه به تعداد زیاد در طی چند نسل با ساب کالچر (subculture) گیاهچه‌ها تکثیر می‌شود.

مرحله‌ی سوم

مرحله‌ی ریشه‌زایی گیاهچه‌ها (Rooting) عموماً با استفاده از اکسین برای ریشه‌دار نمودن گیاهچه‌ها اقدام می‌شود.

مرحله‌ی چهارم

انتقال گیاهچه‌های ریشه‌دار به خاک (پیت موس: پرلیت) در رطوبت بالا و نور کم و به‌تدریج از رطوبت کاسته می‌شود و نور طبیعی افزایش می‌یابد تا سازگاری گیاهان کامل شود (مانند گل زینتی ژربرا)

کشت بافت گیاهی روشی برای تولید متابولیت‌های مفید

گیاهان عالی حاوی تعداد زیادی مواد با ارزش مانند داروها، افزودنی‌های خوراکی، مواد معطر و… می‌باشند. با وجود این، کاهش منابع گیاهی و افزایش هزینه نیروی کار و دیگر مشکلات در به دست آوردن این مواد با ارزش از گیاهان در طبیعت سبب توجه به استفاده از کشت سلول گیاهی در تولید این محصولات شده است.

به علت اینکه کشت سلول گیاهی تحت تأثیر شرایط محیطی مثل خسارت اقلیمی یا طبیعی قرار نمی‌گیرد، امکان تولید مناسب در هر مکان یا هر فصل، عملی خواهد بود. چون سلول‌های گیاهی می‌توانند در فرمان تورهای مختلف مانند بیوراکتورها، مشابه با فرمانتورهای میکروبی کشت شوند.

بسیاری از شرکت‌های صنعتی در ژاپن سعی می‌نمایند تا این تکنولوژی را برای تولید تجاری ترکیبات مفیدی مانند رنگ‌دانه‌های گیاهی و توده سلولی جینسینگ و داروهای ضد سرطان مانند تاکسول بکار برند.

مزایای کشت بافت گیاهی

به دلیل مزایای بسیار زیادی که کشت بافت دارد استفاده از آن در کشاورزی طی سال‌های اخیر رشد قابل‌توجهی داشته است. برخی از مزایای کشت بافت عبارت‌اند از:

1. تکثیر سریع کلون‌ها
2. یکنواختی ژنتیکی
3. گزینش گیاهان با خصوصیات ویژه
4. حفظ گیاه مادری در شرایط مطلوب
5. کنترل شرایط فیزیکی محیط کشت و رشد
6. حفظ ژرم پلاسم گیاهان مختلف
7. تولید هیبریدهای ناسازگار با کشت جنین یا تخمک
8. تولید گیاهان هاپلوئید
9. تولید دائمی گیاهان در تمام فصول سال
10. تکثیر رویشی گیاهان سرسخت

اصول و مبانی کشت بافت گیاهی

محیط کشت و ترکیبات آن

انتخاب محیط کشت یا تهیه‌ی فرمولاسیون آن برای موفقیت در کشت بافت ضروری است. هیچ محیط کشت مشخصی را نمی‌توان برای رشد انواع سلول‌ها توصیه کرد و اغلب لازم است تغییراتی در محیط کشت برای پاسخگویی نیازهای انواع ریز نمونه‌ها صورت گیرد.

تعیین یک محیط کشت بستگی به هدف کشت سلول دارد. به‌طورکلی محیط کشت حاوی نمک‌های معدنی (ماکرو و میکرو) و ترکیبات دیگر مانند تنظیم‌کننده‌های رشد، ویتامین‌ها، کربوهیدرات‌ها، هگزیتول ها و یک عامل ژلی مانند آگار برای جامد کردن محیط کشت می‌باشد. علاوه بر این محیط کشت می‌تواند دارای اسیدهای آمینه، آنتی‌بیوتیک‌ها یا ترکیبات پیچیده‌ی طبیعی نیز باشد.

نمک‌های معدنی

فرمولاسیون نمک‌های معدنی می‌تواند در محیط‌های کشت به‌صورت متفاوتی انتخاب گردد. محیط کشت MS (مورگان و اسکوگ ۱۹۶۲)، فرمولاسیونی است که به‌طور گسترده و به‌عنوان محیط کشت پایه از آن استفاده می‌گردد. نمک‌های ماکرو شامل عناصری همچون پتاسیم، نیترات، منیزیوم، کلسیم، فسفات و آهن می‌باشد که گیاه در مقادیر بالایی به آن‌ها نیاز دارد و نمک‌های میکرو شامل عناصری همچون ید، بور، منگنز، روی، مولیبدن، مس و کبالت می‌باشد که گیاه برای رشد خود در مقادیر بسیار کمی به آن‌ها نیاز دارد.

در جداول زیر ترکیبات نمک‌های معدنی (ماکرو و میکرو) چند محیط کشت مختلف نشان داده‌شده است.

جدول ۱: فرمولاسیون نمک‌های معدنی (عناصر ماکرو) چند محیط کشت برحسب میلی‌گرم در لیتر (اون و میلر ۱۹۹۲)

 جدول ۲: فرمولاسیون نمک‌های معدنی (عناصر میکرو) چند محیط کشت برحسب میلی‌گرم در لیتر (اون و میلر ۱۹۹۲)

 نکته: یدید پتاسیم و آهن باید دور از نور نگه‌داشته شود تا از اکسید شدن جلوگیری شود.

ویتامین‌ها

نقش کاتالیزوری در واکنش‌های آنزیمی به عهده‌ی ویتامین‌ها می‌باشد. ویتامین‌های مهم برای کشت بافت سلول‌های گیاهی شامل تیامین HCL(B_۱)، اسیدنیکوتینیک (B_۳)، پیریدوکسین HCL(B_۶) و میواینوزیتول می‌باشند.

اسیدهای آمینه

اسیدهای آمینه می‌توانند اهمیت زیادی در ریخت‌زایی داشته باشند. گلیسین (Gly) به‌طورمعمول در اکثر محیط‌های کشت دیده می‌شود. تیروزین (Thr) در شاخه زایی و آرژینین (Arg) در ریشه‌زایی می‌توانند مؤثر باشند. هیدرولیزات کازئین، آنزیم هضم پروتئین شیر، نیز گاهی به محیط کشت اضافه می‌گردد (زیرا حاوی چندین اسیدآمینه‌ی مختلف می‌باشد)

کربوهیدرات‌ها

ازآنجایی‌که سلول‌های کشت‌شده، معمولاً ازنظر فتوسنتزی فعال نبوده و به یک منبع کربن نیاز دارند از قندهای مختلفی مانند ساکارز و یا گلوکز در محیط کشت استفاده می‌شود. از سایر کربوهیدرات‌ها مانند فروکتوز و نشاسته نیز می‌توان استفاده نمود. در کشت پروتوپلاست سطوح کمتری از کربوهیدرات‌ها استفاده می‌گردد اما در کشت جنین و بساک به مقدار زیادتری از آن‌ها نیاز است.

تنظیم‌کننده‌های رشد

نوع و غلظت این تنظیم‌کننده‌ها، بسته به موارد استفاده‌ی کشت بافت متفاوت است. متداول‌ترین هورمون‌های رشد جهت ساخت محیط کشت عبارت‌اند از: ایندول-۳-استیک اسید، ایندول-۳-بوتیریک اسید، نفتالین استیک اسید،۲ و ۴-دی کلروفنوکسی استیک اسید،۶-بنزیل آمینوپورین، آبسیزیک اسید، کنیتین، جیبرلیک اسید.

اکسین ها

در اکثر محیط کشت‌های سلولی به‌منظور تقسیم و ریشه‌زایی لازم است. غلظت‌های بالای اکسین می‌تواند مانع ریخت‌زایی گردد. از توفوردی برای القای کالوس و از IBA و NAA و IAA برای ریشه‌زایی استفاده می‌شود.

سیتوکینین ها

باعث تسریع تقسیم سلولی، تشکیل اندام هوایی و ریخت‌زایی می‌شوند. از هورمون TDZ در غلظت‌های کم برای تحریک تشکیل اندام هوایی استفاده می‌شود.

جیبرلین (GA_۳)

به دلیل اثر بازدارندگی آن روی رشد کالوس و نیز اثر بازدارنده آن روی تشکیل ریشه‌های نابجای القا شده در اثر اکسین، بندرت در کشت بافت استفاده می‌شود؛ اما برای تسریع جوانه‌زنی، تحریک طویل شدن فاصله بین گره‌ها و تحریک تشکیل جنین از کالوس در کشت بافت گیاهی مفید می‌باشد.

آبسیزیک اسید (ABA)

به‌عنوان یک بازدارنده رشد محسوب می‌شود. این هورمون می‌تواند در تعدیل سنتز سیتوکینین ها دخالت کند و از نظر اعمال برخلاف جیبرلین رفتار می‌کند.

عوامل ژله‌ای کننده

کشت ریز نمونه، اغلب بر روی بستری ثابت صورت می‌گیرد و به‌طورمعمول از یک عامل جامد کننده در این تکنیک استفاده می‌شود. آگار و ژل رایت ازجمله موادی هستند که برای ژله‌ای کردن محیط کشت استفاده می‌شوند. ازآنجایی‌که آگار از یک جلبک دریایی استخراج می‌گردد، باید خالص‌سازی شود و از انواع بسیار مرغوب آن جهت محیط کشت استفاده گردد.

ژل رایت یک پلی ساکارید حاصل از تخمیر گونه‌ای از باکتری پزودوموناس با ترکیبی پایدار بوده و قیمت بسیار بالایی دارد. علاوه بر آگار در برخی موارد می‌توان از محیط کشت مایع استفاده نمود و برای ایجاد یک بستر ثابت می‌توان از کاغذ فیلتر، پنبه و یا پارچه‌ی نخی استریل استفاده نمود.

آنتی‌بیوتیک‌ها

برای برطرف کردن مشکلات ناشی از آلودگی‌های زیاد در ریز نمونه‌های گیاهی بندرت از آنتی‌بیوتیک‌ها در محیط کشت استفاده می‌شود. لازم به ذکر است که این ترکیبات در اکثر موارد رشد ریز نمونه را به مقدار زیاد کاهش داده و گاهی در غلظت‌های بالا، باعث تولید اندام‌های غیرطبیعی می‌گردند. همچنین ایجاد جهش از دیگر مشکلات ناشی از مصرف این مواد می‌باشد.

آنتی‌اکسیدان‌ها

به‌منظور جلوگیری از نکروزه شدن ریز نمونه‌ها که عمدتاً به دلیل تولید ترکیبات و آلکالوئیدهای فنلی زیاد از ریز نمونه می‌باشد، از ترکیباتی مانند اسیدسیتریک، اسیدآسکوربیک و پیروگالل استفاده می‌گردد تا اکسید شدن ریز نمونه‌ها را کاهش دهند.

ذغال فعال و پلی وینیل پیرولیدون نیز به‌عنوان ترکیبات جاذب برای جذب مواد سمی که برای ریز نمونه مضر می‌باشند، مورد استفاده قرار می‌گیرند. البته این ترکیبات علاوه بر مواد فنلی و مضر، مواد مفید محیط کشت را نیز تا حدی به خود جذب می‌کنند به همین دلیل این‌گونه از محیط‌های کشت باید در زمان‌های کوتاه‌تری واکشت گردند تا همواره مواد موردنیاز گیاه با غلظت مناسب در دسترس ریز نمونه باشد.

مواد آلی

به‌منظور القاء رشد سلول‌ها، گاهی اوقات مواد آلی به محیط کشت اضافه می‌گردد. این مواد شامل عصاره مخمر، عصاره مالت و شیرنارگیل هستند. همچنین شیر نارگیل به‌عنوان یک تأمین‌کننده‌ی تنظیم‌کننده‌های رشد شناخته می‌شود.

pH محیط کشت

اسیدیته ی محیط کشت معمولاً در حدود ۵.۵ تا ۶ تنظیم می‌شود. pH را باید قبل از اضافه کردن آگار اندازه‌گیری کنیم. در pH پایین‌تر از ۵.۵، آگار به‌طور مناسب ژلاتینی نمی‌شود و در pH بالاتر از ۶، ژل به‌صورت خیلی محکم تشکیل می‌شود که در هر دو صورت جذب مواد غذایی توسط ریز نمونه را به‌شدت دچار اختلال می‌کند.

کاهش pH در کشت برخی بافت‌های گیاهی به دلیل تولید اسیدهای آلی می‌باشد. pH محیط کشت تحت تأثیر مواد معدنی، قند، آگار، ذغال فعال و روش نگهداری محیط کشت قرارگرفته و آن را تغیر می‌دهد.

تهیه‌ی ریز نمونه

ریز نمونه، قطعه‌ای از بافت گیاهی است که از آن برای تولید یک گیاه کامل استفاده می‌شود و برای تولید هر گیاه خاص، یک ریز نمونه مشخص استفاده می‌شود. ریز نمونه می‌تواند در واکنش به زخم ایجادشده، تولید کالوس (توده‌ای از سلول که در اثر تقسیم به وجود آمده و تمایز نیافته است) نماید.

عوامل مربوط به انتخاب ریز نمونه مناسب

سن ریز نمونه

بافت‌های جوان‌تر از نظر فیزیولوژیکی پاسخ بهتری به کشت بافت می‌دهند. همچنین آلودگی در این بافت‌ها کمتر دیده می‌شود.

فصل تهیه‌ی ریز نمونه

ریز نمونه‌های انتخاب‌شده در فصل بهار کمترین آلودگی (قارچی و باکتریائی) و بالاترین پاسخ‌دهی به رشد را دارا می‌باشد. در زمستان کمترین پاسخ‌دهی به کشت دیده می‌شود. بافتی که ازنظر فیزیولوژیکی در خواب است معمولاً تا پس از دوران خواب، به کشت بافت پاسخ نمی‌دهد. بالاترین درصد آلودگی در پاییز و زمستان دیده می‌شود.

اندازه و محل برش گیاه برای تهیه‌ی ریز نمونه

معمولاً کشت ریز نمونه کوچک‌تر، سخت‌تر بوده و محیط کشت باید حاوی ترکیبات اضافی باشد. ریز نمونه‌های بزرگ‌تر، احتمالاً از مواد غذایی و تنظیم‌کننده‌های رشد بیشتری برخوردار بوده و برای کشت مناسب‌تر هستند (معمولاً ۳ میلی‌متر بالای جوانه و ۳ میلی‌متر پایین جوانه را جهت تهیه‌ی ریز نمونه جوانه، برش می‌زنند). همچنین گیاهان در قسمت‌های مختلف دارای تعادل هورمونی متفاوتی هستند و این تفاوت منجر به پاسخ‌های متفاوتی در محیط کشت درون شیشه می‌شود.

کیفیت منابع گیاهی

گیاهان سالم، عاری از ویروس، گیاهان بدون تنش غذایی، آبی یا محیطی و گیاهان دارای بازدهی بالای محصول (بهترین گیاه از تمام لحاظ) بهترین انتخاب برای تهیه‌ی ریز نمونه می‌باشند.

هدف نهایی از کشت بافت

بسته به نوع پاسخ مطلوب از کشت سلول، انتخاب بافت ریز نمونه متفاوت خواهد بود. هر قطعه از بافت گیاهی می‌تواند به‌عنوان یک ریزنمونه استفاده شود. به‌عنوان‌مثال اگر هدف تکثیر انبوه کلون باشد، ریزنمونه معمولاً جوانه جانبی و انتهایی و یا ساقه هوایی می‌باشد. برای القای کالوس زایی از ساقه، برگ، میانگره، هیپوکوتیل و یا جنین استفاده می‌شود.

بافت برگ حاصل از بذر تازه جوانه‌زده استریل، منبع بافتی مناسبی برای تهیه پروتوپلاست است. برای تهیه گیاه هاپلوئید از کشت بساک یا دانه‌ی گرده استفاده می‌گردد. در کشت گیاهان چوبی بیشتر از قسمت‌های هوایی ریز نمونه می‌گیریم.

آلودگی در کشت بافت گیاهی

تهیه‌ی کشت‌های استریل در بعضی از مواد گیاهی یکی از مشکلات عمده در کشت بافت می‌باشد. علاوه بر این، مرحله‌ی ضدعفونی یک مرحله‌ی وقت‌گیر و به‌واسطه‌ی امکان از دست رفتن نمونه گیاهی پرهزینه می‌باشد.

منابع آلودگی

منابع آلودگی شامل ریزنمونه، پرسنل آزمایشگاه، اتاقک استریل، حشرات مانند کنه و مورچه، محیط کشت، تجهیزات آزمایشگاهی و سیستم کنترل‌کننده‌ی تهویه‌ی آزمایشگاه می‌باشد.

استریل کردن ریزنمونه

میکروارگانیسم‌ها روی سطح ریز نمونه، در شکاف‌های کوچک، در برگ‌های در حال رشد، جوانه‌ها و… وجود دارند. همچنین بسیاری از گیاهان درون سیستم آوندی خود دارای آلودگی می‌باشند. برای حذف آلودگی‌های ریز نمونه می‌توان از مواد ضدعفونی‌کننده زیر استفاده کرد:

1. هیپوکلریت سدیم (NaOcl): وایتکس خانگی با غلظت ۵.۲۵ درصد (برای بعضی از ریز نمونه‌ها غلظت را باید تا ۱ درصد پایین آورد)
2. هیپوکلریت کلسیم (Ca(Ocl_۲)) غلظت ۰.۸ درصد
3. اتانول ۷۰ درصد که با هیپوکلریت سدیم همراه هم عمل می‌کنند (ریزنمونه بیشتر از ۱ دقیقه نباید داخل اتانول قرار گیرد)
4. پروکسید هیدروژن (H_۲O_۲) با غلظت ۳-۱۰ درصد
5. گاز کلر (Cl_۲) که برای ضدعفونی بذور خشک مؤثر است
6. قار چکش‌ها مانند کاپتان
7. آنتی‌بیوتیک‌ها مانند جنتامایسین و آمپی سیلین با غلظت ۵۰-۱۰۰ میلی‌گرم در لیتر (جهت ضدعفونی محیط کشت از آن استفاده می‌گردد)

ضدعفونی کردن پرسنل آزمایشگاه

شستشوی دست‌ها تا بالاتر از مچ، استفاده از دستکش و لباس استریل، استفاده از تورهای محافظ موی سر و ماسک در کاهش انتقال آلودگی به محیط کشت و ریز نمونه تا حدی مؤثر است.

ضدعفونی اتاقک استریل و استفاده از دستگاه لامینار فلو (Laminair Flow) که به میزان ۹۹.۹۷ درصد از ورود ذرات ۰.۳ میکرونی جلوگیری می‌کند.

جلوگیری از ورود حشرات به آزمایشگاه و ظروف کشت

مسدود کردن منافذ ورودی و استفاده از پارافیلم برای بستن ظروف کشت.

استریل سازی محیط کشت بافت

محیط کشت بافت معمولاً در دمای ۱۲۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵-۲۰ دقیقه و تحت‌فشار ۱.۱ بار اتوکلاو استریل می‌شود. موادی مانند جیبرلین که به حرارت حساس هستند، با فیلترهای میلی پور با سایز ۰.۲۲ میکرون استریل گشته و پس از سرد شدن محیط کشت به آن اضافه می‌شوند.

استریل سازی وسایل آزمایشگاه

پنس، اسکالپل، کاغذ، بشر و سایر وسایل فلزی و شیشه‌ای را می‌توان با حرارت خشک آون (در دمای ۱۸۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳ ساعت) استریل نمود و در حین کشت نیز از چراغ الکلی و یا دستگاه استریلایزر استفاده نمود.

جمع بندی

کشت بافت به دلیل مزایای فراوانی که دارد در دهه‌های اخیر موردتوجه بسیاری از کشاورزان و تولیدکنندگان قرارگرفته است. از مهم‌ترین مزیت‌های این روش کشت در گیاهان نسبت به روش‌های سنتی مانند کشت مستقیم بذر و قلمه زدن می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

1. تولید تیراژ بسیار زیاد از تعداد کمی گیاه در مدت‌زمان کوتاه
2. انتقال خصوصیات گیاه مادر به نسل‌های بعدی در اصلاح نباتات و تولید گیاهان هیبرید
3. تولید گیاهان عاری از باکتری و ویروس و احیا گیاهان در معرض انقراض

گیاهان زینتی مانند رز هلندی، گل محمدی، استویا و گیاهان آکواریومی در اکثر مناطق دنیا با روش کشت بافت تکثیر می‌شوند.